Observation de protoplastes :
Comment optimiser l’utilisation du mélange enzymatique du kit « PROT 1» de chez Sordalab. Il coute 35€ pour 100 ml de solution finale.
dominique.trovatello@ac-aix-marseille.fr
RESSOURCE :
Les protoplastes sont des cellules végétales sans paroi, gorgées de chloroplastes, que l’on obtient par digestion de la paroi pectocellulosique. Pour ce faire, deux types d’enzymes sont nécessaires : - Pectinase (hydrolyse de la pectine) - Cellulase (hydrolyse de la cellulose) Le tampon phosphate permet d’établir une solution de pH=6 afin de stimuler l’activité des enzymes tout en préservant l’intégrité des cellules. Le Mannitol est utilisé à forte concentration (milieu hypertonique) afin de plasmolyser de manière irréversible les cellules : le Mannitol ne rentre pas dans les cellules, cela permet d’éviter l’éclatement par entrée d’eau en absence de paroi. |
Représentation schématique de l'isolement de protoplastes par digestion enzymatique A-tissu chlorophyllien (lamelle moyenne en rose, paroi cellulosique en bleu); B-plasmolyse des cellules: les protoplastes in situ se séparent de leur paroi; C-digestion de la lamelle moyenne par des pectinases: les cellules se séparent; D-digestion de la paroi cellulosique par des cellulases: les protoplastes sont libres dans le milieu. (Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/protoplastes/5-protoplaste-enzymes.htm) |
MANIPULATION A FAIRE EN AMONT AU LABORATOIRE:
Pour son utilisation optimale, nous avons fait des alicots de 5 ml du mélange enzymatique version 100 ml que nous avons congelé. La version concentrée à 50 ml n’a pas donné de meilleurs résultats.
Comme une goutte d’échantillon par binôme suffit pour la manipulation, un alicot de 5 ml suffit largement pour un groupe de 8 binômes (il suffit pour faire tremper une dizaine d’échantillons). Par conséquent, de cette façon, un kit permet de faire travailler 10 classes.
- Verser 5 ml du mélange enzymatique dans 2 boîtes de pétri (DIAMETRE 55mm) jusqu’à obtenir 2mm d’épaisseur (donc 2 tubes décongelés).
- Enlever l’épiderme des 2 cotés de la feuille à l’aide d’une petite pince pointue (ou scalpel, c’est plus facile)
- Découper des fragments de feuille pelée de moins de 1cm, puis les déposer dans le mélange enzymatique. Prévoir une dizaine de fragments par boite de pétri.
- Faire tourner la boite pour bien recouvrir les morceaux de mélange enzymatique.
- Incuber 1h30 à 37°C ou 3h00 à 25°C.
Attention !
La température et le temps de migration sont très importants : test fait à 37° à l’étuve :
- En ½ heure aucun résultat
- En 1 heure quelques très rares protoplastes (c’est pour ça que ça ne peut pas être fait en classe)
- En 1 h 30 de nombreux protoplastes
- En 3 h restent quelques protoplastes mais la majorité des cellules se sont vidées
Après incubation de 1 h 30 à 37 °, il est possible de conserver la boîte avec les fragments de feuille au réfrigérateur, au plus 10 h.
MATERIEL NECESSAIRE PAR BINOME:
- Feuille de poireau bien verte
- lame en verre
- lamelles
- 2 petites boites de pétri
- un verre de montre
- Une micropipette réglée sur 20 µL plus cônes jaunes
- 1 marqueur
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- Un scalpel
- Pince
- Ciseaux
- Un tube avec du glucose marqué solution d’incubation
- Un tube avec de la solution tampon pH 6
- Microscope
- étuve
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Sur la paillasse du professeur :
La boite de pétri avec les fragments de feuille digérés
OBSERVATION :
Il est nécessaire afin de conserver l’intégrité des protoplastes de fabriquer une chambre d’incubation composée d’une lame en verre et trois lamelles :
Sur une lame en verre, disposer deux lamelles de la façon suivante :
Déposer une goutte de la solution d’incubation entre les deux lamelles puis recouvrir d’une autre lamelle sans effectuer de pression :
Observer au grossissement X400.
Note : L’épaisseur des lamelles par rapport à la lame n’est pas proportionnelle...
Attention !
Pour une observation à un grossissement supérieur, la chambre d’incubation ne peut pas être utilisée (mise au point impossible, focale non adaptée).
Dans ce cas, faire une observation classique entre lame et lamelles.
PROTOCOLE ELEVES
- verser les 5 mL de la solution enzymatique dans une petite boîte de Pétri
- Découper deux petits morceaux de feuille de poireau (environ 0,5 cm2)
- Enlever l’épiderme des deux côtés en grattant ou pelant délicatement à l’aide d’un scalpel
Du fait de sa rigidité, l’épiderme constitue une barrière qui s’opposerait à l’action des enzymes
- Déposer les morceaux dans la solution enzymatique
- Refermer la boîte et identifier-la en écrivant « +Enz » sur le bord
- Renouveler les opérations précédentes en utilisant la solution tampon. Nommez cette boîte « –Enz »
- Amener les boîtes au poste professeur afin de les incuber pendant 1h30 à 37°C
- Récupérer un échantillon déjà incubé (paillasse du professeur) dans un verre de montre puis
- Observer les 2 échantillons entre lame et lamelle ou dans une chambre d’incubation selon le grossissement utilisé
RESULTATS :
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Début de la macération d’une feuille de poireau dans les enzymes : les cellules les plus externes se séparent |
Surnageant brut avant purification contenant des protoplastes et différents débris de tissus (cellules spiralées des vaisseaux conducteurs) |
(Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/protoplastes/5-protoplaste-enzymes.htm)