Activités pédagogiques testées

Publié le 7 mai 2020

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Le  jeudi 7 mai 2020

Observation de protoplastes

Comment optimiser l’utilisation du mélange enzymatique du kit « PROT 1» de chez Sordalab. dominique.trovatello@ac-aix-marseille.fr

  • image microscopique de protoplaste X400

     

    Observation de protoplastes :

     

    Comment optimiser l’utilisation du mélange enzymatique du kit « PROT 1» de chez Sordalab. Il coute 35€ pour 100 ml de solution finale.

    dominique.trovatello@ac-aix-marseille.fr

    RESSOURCE :

     

    Les protoplastes sont des cellules végétales sans paroi, gorgées de chloroplastes, que l’on obtient par digestion de la paroi pectocellulosique.

    Pour ce faire, deux types d’enzymes sont nécessaires :

    - Pectinase (hydrolyse de la pectine)

    - Cellulase (hydrolyse de la cellulose)

    Le tampon phosphate permet d’établir une solution de pH=6 afin de stimuler l’activité des enzymes tout en préservant l’intégrité des cellules.

    Le Mannitol est utilisé à forte concentration (milieu hypertonique) afin de plasmolyser de manière irréversible les cellules : le Mannitol ne rentre pas dans les cellules, cela permet d’éviter l’éclatement par entrée d’eau en absence de paroi.

     

     

    Représentation schématique de l'isolement de protoplastes par digestion enzymatique
    A-tissu chlorophyllien (lamelle moyenne en rose, paroi cellulosique en bleu);
    B-plasmolyse des cellules: les protoplastes in situ se séparent de leur paroi;
    C-digestion de la lamelle moyenne par des pectinases: les cellules se séparent;
    D-digestion de la paroi cellulosique par des cellulases: les protoplastes sont libres dans le milieu.

    (Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/protoplastes/5-protoplaste-enzymes.htm)

     

     

    MANIPULATION A FAIRE EN AMONT AU LABORATOIRE:

     

    Pour son utilisation optimale, nous avons fait des alicots de 5 ml du mélange enzymatique version 100 ml que nous avons congelé. La version concentrée à 50 ml n’a pas donné de meilleurs résultats.

    Comme une goutte d’échantillon par binôme suffit pour la manipulation, un alicot de 5 ml suffit largement pour un groupe de 8 binômes (il suffit pour faire tremper une dizaine d’échantillons). Par conséquent, de cette façon, un kit permet de faire travailler 10 classes.

    • Verser 5 ml du mélange enzymatique dans 2 boîtes de pétri (DIAMETRE 55mm) jusqu’à obtenir 2mm d’épaisseur (donc 2 tubes décongelés).
    • Enlever l’épiderme des 2 cotés de la feuille à l’aide d’une petite pince pointue (ou scalpel, c’est plus facile)
    • Découper des fragments de feuille pelée de moins de 1cm, puis les déposer dans le mélange enzymatique. Prévoir une dizaine de fragments par boite de pétri.
    • Faire tourner la boite pour bien recouvrir les morceaux de mélange enzymatique.
    • Incuber 1h30 à 37°C ou 3h00 à 25°C.

     

    Attention !

     

    La température et le temps de migration sont très importants : test fait à 37° à l’étuve :

    • En  ½ heure aucun résultat
    • En 1 heure quelques très rares protoplastes (c’est pour ça que ça ne peut pas être fait en classe)
    • En 1 h 30 de nombreux protoplastes
    • En 3 h restent quelques protoplastes mais la majorité des cellules se sont vidées

     

    Après incubation de 1 h 30 à 37 °, il est possible de conserver la boîte avec les fragments de feuille au réfrigérateur, au plus 10 h.

     

    MATERIEL NECESSAIRE  PAR BINOME:

     

    • Feuille de poireau bien verte
    • lame en verre
    • lamelles
    • 2 petites boites de pétri
    • un verre de montre
    • Une micropipette réglée sur 20 µL plus cônes jaunes
    • 1 marqueur
     
    • Un scalpel
    • Pince
    • Ciseaux
    • Un tube avec du glucose marqué solution d’incubation
    • Un tube avec de la solution tampon pH 6
    • Microscope
    • étuve

     Sur la paillasse du professeur :

     

    La boite de pétri avec les fragments de feuille digérés

     

    OBSERVATION :

     

    Il est nécessaire afin de conserver l’intégrité des protoplastes de fabriquer une chambre d’incubation composée d’une lame en verre et trois lamelles :

    Sur une lame en verre, disposer deux lamelles de la façon suivante :

     

    Déposer une goutte de la solution d’incubation entre les deux lamelles puis recouvrir d’une autre lamelle sans effectuer de pression :

     

    Observer au grossissement X400.

    Note : L’épaisseur des lamelles par rapport à la lame n’est pas proportionnelle...

     

    Attention !

     

    Pour une observation à un grossissement supérieur, la chambre d’incubation ne peut pas être utilisée (mise au point impossible, focale non adaptée).

     Dans ce cas, faire une observation classique entre lame et lamelles.

     

    PROTOCOLE ELEVES

     

    • Ÿ verser les 5 mL de la solution enzymatique dans une petite boîte de Pétri
    • Ÿ Découper deux petits morceaux de feuille de poireau (environ 0,5 cm2)
    • Ÿ Enlever l’épiderme des deux côtés en grattant ou pelant délicatement à l’aide d’un scalpel

    Du fait de sa rigidité, l’épiderme constitue une barrière qui s’opposerait à l’action des enzymes

    • Ÿ Déposer les morceaux dans la solution enzymatique
    • Ÿ Refermer la boîte et identifier-la en écrivant « +Enz » sur le bord
    • Ÿ Renouveler les opérations précédentes en utilisant la solution tampon. Nommez cette boîte « –Enz »
    • Ÿ Amener les boîtes au poste professeur afin de les incuber pendant 1h30 à 37°C
    • Ÿ Récupérer un échantillon déjà incubé (paillasse du professeur) dans un verre de montre puis
    • Ÿ Observer les 2 échantillons entre lame et lamelle ou dans une chambre d’incubation selon le grossissement utilisé

     

    RESULTATS :

     

       

    Début de la macération d’une feuille de poireau dans les enzymes : les cellules les plus externes se séparent

    Surnageant brut avant purification contenant des protoplastes et différents débris de tissus (cellules spiralées des vaisseaux conducteurs)

    (Source : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/protoplastes/5-protoplaste-enzymes.htm)